Met meer dan 100.000 levende schimmels, gisten en bacteriën heeft het Westerdijk Fungal Biodiversity Institute in Utrecht de grootse publieke collectie ter wereld op dit gebied. Vanuit de collectie aan schimmels, die jaarlijks met enkele duizenden nieuwe stammen groeit, worden in datzelfde tijdsbestek gemiddeld om en nabij de 5.000 schimmelcultures naar onderzoekers over de hele wereld verzonden. Hiervoor is een verregaand gedigitaliseerd logistiek systeem ontwikkeld met als meest kritische stappen het invriezen en ontdooien van deze micro-organismen.
Echte hardlopers zijn er niet tussen de 22.000 soorten en 7.000 genera van schimmels die deel uitmaken van de publieke collectie van het Westerdijk Fungal Biodiversity Institute. Volgens Gerard Verkleij, curator van de schimmelcollectie van dit KNAW-instituut, zit dan ook een deel van de aantrekkingskracht van de collectie in de breedte en compleetheid.
“We ontvangen veel aanvragen van klanten die werken op het gebied van biodiversiteit, en dus vaak een brede selectie maken uit onze collectie. Verder brengt ook de diversiteit van het onderzoek aan schimmels met zich mee dat de schimmels bij wijze van spreken uit alle hoeken en gaten van de collectie te voorschijn worden gehaald. Om van die diversiteit een goede indruk te krijgen hoef je alleen maar te kijken naar de thema’s waar de onderzoeksgroepen binnen ons instituut zich mee bezighouden. Dat gaat van allerhande medische onderwerpen en plantgezondheid tot aan industriële processen zoals biodegradatie met behulp van schimmels.
Een ander speerpunt, waar ook vanuit het bedrijfsleven steeds meer belangstelling voor is, is het vinden van toepassingen voor de bio-actieve stoffen die de schimmels produceren. Dat kan zowel op basis van wat ze uitscheiden in reincultures als op basis van hun genomen, het DNA dus. Ook vinden veel van onze schimmels aftrek voor voedselonderzoek, waar ze in allerlei aspecten een belangrijke rol spelen, zoals voedselproductie, verbetering van smaakeigenschappen, maar ook voedselbederf. Een ander thema waar steeds meer belangstelling voor komt is indoor mycology: schimmels die in het binnenmilieu voorkomen en daar tot allerlei problemen kunnen leiden.”
De cryo-installatie met dertien stikstofvaten van de collectie van schimmelcultures wordt onderhouden door Cryo Solutions. In dat kader zijn het afgelopen jaar twee vaten gereviseerd, waarbij ze zijn uitgerust met een CryoFill vulautomaat.
Biodiversiteit in kaart brengen
Waar pas de laatste jaren het grote publiek enigszins doordrongen lijkt te raken van het belang van biodiversiteit, was het in 1904 opgerichte ‘Centraal Bureau voor Schimmelcultures’ zijn tijd ver vooruit met de missie om de biodiversiteit van het schimmelrijk in kaart te brengen door het preserveren en bewaren van levende culturen van schimmels. Gestart met 60 cultures van, deels pathogene, stammen van suikerrietplantages uit Azië, is de collectie in ruim honderd jaar enorm uitgebreid. Dat is deels door toedoen van eigen onderzoekers die bijvoorbeeld uit grondmonsters schimmels isoleren en aan de hand van DNA-karakterisering bepalen of het gaat om een onbekende, nog niet beschreven soort.
Deze stam wordt dan beschreven en aangewezen als type stam, hèt referentiemateriaal voor die nieuwe soort. De soort wordt vervolgens gepubliceerd en de stam wordt in de collectie gedeponeerd. Daarnaast sturen onderzoekers van over de hele wereld, die zich bezighouden met het isoleren en karakteriseren van schimmels, nieuw ontdekte soorten op naar Utrecht. Die hebben vaak niet zelf de kennis en faciliteiten om culturen langdurig te bewaren.
Langdurige opslag
In de begintijd was de opslag gebaseerd op de klassieke methode van het in leven houden van een schimmel op een kunstmatige voedingsbodem. Zolang de schimmel voldoende te eten heeft, gaat dat goed. En door hem koud op te slaan, eet hij minder. Maar op een zeker moment zal zo’n organisme, omdat het metabolisme niet helemaal naar nul gaat, versterven. Om dat te voorkomen moet je bij tijd en wijle de schimmel overenten op een verse bodem. Dat arbeidsintensieve proces was met een paar duizend schimmels misschien nog wel te doen, maar daar hoef je met de inmiddels tienduizenden schimmels niet aan te beginnen. In de vijftiger jaren van de vorige eeuw werd daarnaast begonnen met vriesdrogen, een methode die nog steeds wordt toegepast.
“Om tijdens het invriezen vorming van interne ijskristallen te vermijden en daarna tijdens het het droogproces de celcomponenten stabiel te houden, worden stoffen toegevoegd, de cryoprotectanten. Hiervoor gebruiken we een oplossing van magere melkpoeder in steriel water, waar we soms bepaalde suikers aan toevoegen. Na invriezen van de sporen van een schimmel in die vloeistof vriesdrogen we de oplossing onder vacuüm bij lage temperaturen. Het gesublimeerde product is nog wel levensvatbaar omdat de celstructuren op een zodanige wijze zijn gedroogd en worden beschermd door de protectanten, dat ze niet beschadigd zijn. De materialen, die zijn ondergebracht in vacuüm getrokken glasampullen, kunnen zo jarenlang worden bewaard bij een temperatuur van 6 à 7 °C.
Cryopreservatie
Ook bij de nu meest toegepaste methode, het in vloeibare stikstof brengen en bewaren, is het zaak om te voorkomen dat er bij het invriezen ijskristallen in de cellen ontstaan. Hiervoor wordt een 10% glycerol oplossing gebruikt. In de praktijk zijn opslagtemperaturen van om en nabij de -185 °C haalbaar. “Het mag niet uitmaken of je de schimmels na 10, 20 of 50 jaar opslag ontdooit; ze moeten dan nog steeds levensvatbaar zijn. Op basis van onze ervaringen durf ik ook wel te stellen dat dit ook na 100 jaar nog het geval zal zijn, mits je de bewaaromstandigheden goed houdt”, aldus Gerard. De -185 °C is een realistische temperatuur, mits het vat goed vol zit en het opslagsysteem zelf tenminste van aluminium is. “Sla je op in kartonnen dozen dan zijn er gebieden waar de temperatuur hoger wordt. Dat gaat niet goed, zeker als het vat niet vol zit”, zegt Gerard.
“Bedenk daarbij dat we de maximaal 13.000 rietjes met stammen die we in een Taylor Wharton 24 K vat kunnen huizen, niet in de vloeibare stikstof zelf (dat is circa -196 °C), maar in de dampfase opslaan. Daarvoor zijn de vaten ingericht voor een dynamische gasfase. Deze vaten hebben een vacuüm buitenmantel voor de isolatie. In het binnenwerk zit een ruimte waarin de vloeibare stikstof zit. In die ruimte staat een metalen bak, waarin we de monsters opslaan in een ijzeren frame. In het frame passen 17 torens waarin we lades met rietjes kunnen schuiven. De vloeibare stikstof komt door deze constructie niet in contact met het materiaal. Omdat het vat zo is ingericht dat de ruimte voor de vloeibare stikstof net hoger is dan de bak waarin het materiaal zit, valt de damp die naar boven komt over de rand in de bak met het frame met de materialen. Daar vindt continu menging plaats. In het frame zit alleen bevroren materiaal. Als die helemaal vol zit heb je een dusdanig dynamische gasfase in je opslagsysteem dat de temperatuur in het hele opslaggedeelte, van de bodem tot net onder het deksel, nagenoeg gelijk is. Dat is cruciaal.”
De dynamische gasfase in het opslagsysteem maakt dat de temperatuur in het hele opslaggedeelte, van de bodem tot net onder het deksel, nagenoeg gelijk is .
foto: Thijs Rooimans Fotografie
Gerard Verkleij, curator van de schimmelcollectie van het Westerdijk Fungal Biodiversity Institute, is sinds 2019 ook voorzitter van de ECCO, de European Culture Collections’ Organisation’.
Continue monitoring
Voor een betrouwbare cryogene opslag in de momenteel dertien vaten is het cruciaal dat ieder vat voortdurend wordt gemonitord op stikstofniveau en temperatuur. Hiervoor zijn de vaten uitgerust met niveausensoren op meerdere hoogtes en ook PT100-sensoren voor de temperatuurmeting. Bij een bepaalde hoogte van het stikstofniveau gaat er een signaal naar het vulsysteem, waarna vanuit de met de buren van het Hubrecht Institute gedeelde 18.000 liter bulktank de stikstof via een vacuüm leidingsysteem per drie vaten tegelijk automatisch wordt bijgevuld, in de regel een procedure die voor ieder vat één keer per dag (meestal in de nacht) plaatsvindt. Twee van de oudste vaten zijn het afgelopen jaar door Cryo Solutions gereviseerd. Hierbij zijn ze ook uitgerust met het automatisch vulsysteem CryoFill, dat er voor zorgt dat de vaten op tijd worden voorzien van vloeibare stikstof.
“Op termijn zullen andere vaten ook wel een keer hiervoor in aanmerking komen, maar dat is afhankelijk van de staat van onderhoud en die is op zich prima, niet in de laatste plaats vanwege het contract dat we –ook in het licht van de ISO9001-certificering van het hele collectiegebeuren– met Cryo Solutions hebben afgesloten voor preventief onderhoud. Hierbij kalibreren ze de temperatuurmeters, kijken naar de functionaliteit, beoordelen de kwaliteit van sluitingen, enzovoorts. Bij de twee vaten die aan revisie toe waren is ondermeer de mantel aan de buitenkant opnieuw gespoten en is een nieuw deksel aangebracht, waarin ook de CryoFill met een modern display is verwerkt. Het binnenwerk was nog relatief goed; daar kregen we zelfs complimenten over. Dat heeft te maken met het tijdig weghalen van ijs. Er vriest namelijk heel veel aan, en als je dat niet weghaalt heb je kans dat je intern schade krijgt aan je ringen, en ook aan je sensoren. Het interne vulsysteem was echter aan zijn eind. Dat is compleet met het sensorsysteem vervangen. De vaten zien er nu weer top uit en ze werken zeer betrouwbaar.”
Op de laatste bijeenkomst van de ECCO, de European Culture Collections Organisation’, in Turijn vond voor het eerst een fotowedstrijd plaats, die met deze foto van Penicillium chrysogenum werd gewonnen door Jan Dijksterhuis en Wim van Egmond van het Westerdijk Institute (foto: Jan Dijksterhuis, Westerdijk Institute).
Veiligheid voor alles
De vaten zijn ook voorzien van automatische alarmering voor een te laag stikstofniveau of een te hoge temperatuur, die is gekoppeld aan het gebouwbeheersysteem (GBS), dat op zijn beurt weer een SMS kan sturen richting de dienstdoende medewerker van de technische dienst. In de alarmen zit enige vertraging, omdat het wel eens voorkomt dat een vat een melding geeft, terwijl het probleem daarna snel vanzelf is opgelost. Als de vertragingsperiode voorbij is, en het probleem heeft zich nog niet opgelost, dan wordt het alarm wel doorgemeld, waarna het eventueel ook bij een medewerker van de collectie komt. “Niemand mag aan de materialen komen, behalve de verantwoordelijke mensen. Als een vat open moet, dan moet er iemand van onze afdeling bij zijn”, zegt Gerard stellig. Ook de ruimte zelf wordt beveiligd, middels een aantal zuurstofsensoren die op 1 meter hoogte hangen. Als het zuurstofniveau op 18,2 % komt, produceert het systeem enorm veel geluid in de ruimte en gaat er een zwaailicht branden, zodat personen ter plekke direct weten dat ze de ruimte moeten verlaten. In dit geval is er direct een doormelding naar het GBS. Bovendien gaat er automatisch een ventilatiesysteem werken, waarbij in de opslagruimte van bovenaf door roosters verse lucht met zuurstof wordt binnengeblazen en via roosters in de vloer de zwaardere stikstof wordt afgevoerd. Als extra veiligheidsmaatregel draagt het personeel zelf ook een zuurstofsensor bij zich, zodat ze te allen tijde ook hun persoonlijke veiligheid kunnen checken. “Dat lijkt een beetje dubbelop, maar liever teveel veiligheidsmaatregelen dan te weinig: veiligheid gaat voor alles!”
Meer informatie:
Het Amazon van de schimmels
In de begintijd van Amazon werd het internetbedrijf geroemd om zijn ‘long tail’. Ze verkochten van boeken en CD’s niet alleen de bestsellers, maar konden ook de meest obscure titels pijlsnel leveren, niet in de laatste plaats door de uitgekiende digitalisering van het voorraadbeheer. Bij de schimmelcollectie gaat het er feitelijk niet veel anders aan toe. Alle informatie over stammen in de collectie is digitaal beschikbaar in databases en de openbare informatie is toegankelijk via een website.
Om snel materiaal uit te kunnen leveren wordt er naar gestreefd om van iedere stam acht items op voorraad te hebben, bij voorkeur zowel in de gevriesdroogde vorm als in de stikstofvaten. Bij bestelling neemt een medewerker een of meer items uit de database-voorraad en zorgt dat die informatie in de vorm van ‘pick-list’ naar de analist gaat. Die haalt de items op uit de fysieke opslag en maakt ze klaar voor verzending. Op dat moment houdt de vergelijking met Amazon wel een beetje op, vooral bij de schimmels uit de cryopreservatie, waarbij het organisme voor verzending eerst wordt geactiveerd om de levensvatbaarheid, kwaliteit en identiteit te beoordelen. Het ontdooien luistert daarbij vrij nauw. Als je langzaam opwarmt heb je de kans dat een deel eerst in watervorm komt, en daarna toch weer bevriest. Door dit proces in handwarm water uit te voeren gaat dat wel goed.
Eenmaal ontdooid wordt de inhoud van een rietje onder steriele condities op een voedingsbodem gebracht, waar na een paar dagen groeien in een entkast bij goed resultaat de schimmels worden overgeënt in buizen, die uiteindelijk worden verstuurd.
foto: Thijs Rooimans Fotografie