Onderzoeksanalist Stieneke van den Brink werkt al bijna 40 jaar bij het Hubrecht Institute in Utrecht. In die hoedanigheid stond en staat ze vooraan bij de spectaculaire ontwikkelingen rond organoïden. Letterlijk wel te verstaan, want in de groep van Hans Clevers werkte zij in 2007 met Toshiro Sato als een van de eersten ter wereld aan het kweken van mini-organen in het laboratorium. Sindsdien heeft zij met haar collega’s het kweken van organoïden steeds verder verfijnd.
Onderzoeksanalist Stieneke van den Brink werkt al bijna 40 jaar bij het Hubrecht Institute. Naast het bereiden van media en het kweken van organoïden verzorgt ze voor het instituut een gedeelte van de inkoop, met name op het gebied van chemicaliën, biologicals en plastics.
Op den duur zullen ook ziekenhuizen zelf organoïden kunnen maken. Bijvoorbeeld van tumorweefsel van een patiënt, dat in de dagen dat hij of zij herstelt van een operatie, kan worden opgekweekt tot een serie organoïden, die vervolgens high-throughput in 384-welletjes kunnen worden getest op de effectiviteit van verschillende behandelingen, bijvoorbeeld chemokuren. Je kunt dan ook direct organoïden van gezond weefsel van de patiënt maken en die laten meelopen met de testen, zodat je ook een beeld hebt van de uitwerking van die behandelingen op de gezonde cellen, of er eventueel beschadigingen ontstaan. Op die manier kan je vooraf patiëntspecifiek de optimale behandeling bepalen”, schetst Stieneke van den Brink, onderzoeksanalist bij het Hubrecht Institute, een toekomstig scenario rond de technologie van (het kweken van) organoïden. Zover is het nog niet met deze driedimensionale, zelf-organiserende structuren die zijn gegroeid vanuit stamcellen. Want niet alleen praktisch komt er heel wat bij kijken om kwalitatief goede organoïden te kweken, maar het is ook nog eens arbeidsintensief en duur.
“Ruim tien jaar na het kweken van de eerste organoïden maken we nog steeds optimaliseringsslagen, slijpen we recepten en protocollen bij”, stelt Stieneke, die in 2007 min of meer toevallig betrokken was bij de eerste pogingen om organoïden te kweken. “Ik werkte destijds in de groep van Christine Mummery, waar we onderzoek deden aan embryonale muizenstamcellen en ook als eerste in Nederland menselijke embryonale stamcellen introduceerden. Toen Christine haar onderzoek voortzette aan het LUMC in Leiden heb ik er voor gekozen om bij het Hubrecht Institute te blijven. Hans Clevers vroeg mij om bij hem in de groep te komen, met name omdat er pas een Japanse onderzoeker was komen werken die iets spannends deed waar mijn expertise in het maken van 3D-culturen van muizenstamcellen wel van pas zou kunnen komen. Achteraf gezien is het best wel grappig dat je op dat moment absoluut niet beseft dat je met het maken van de eerste organoïden uit muizenstamcellen met iets bezig bent dat later zo’n enorme impact heeft. En dat je dat ook nog eens aan de zijde van Toshi Sato hebt gedaan, die toentertijd zeker niet direct alle handen op elkaar kreeg voor zijn ideeën, maar nu toch wereldwijd één van de autoriteiten is op het gebied van organoïden!”
‘Devil in the details’
In zekere zin zou je die autoriteit ook aan Stieneke zelf kunnen meegeven, vooral wat betreft de praktische uitvoering. Haar recepten voor kweekmedia en procedures voor het maken van organoïden gaan via de vele publicaties van het Hubrecht Institute de hele wereld over. Zelfs bedrijven, die kweekmedia commercieel aanbieden, baseren zich op de methoden uit het Hubrecht Institute. Niet dat die commerciële media door Stieneke worden gebruikt: “Ik vind ze van mindere kwaliteit dan de media die wij zelf bereiden. Bovendien zijn ze niet bepaald goedkoop; te duur in ieder geval om vanuit onze onderzoeksbudgetten te bekostigen.” ➞ Het kweken van organoïden is op zich geen ingewikkeld werk.
De uitdaging zit hem vooral in het tot in de kleinste details uitdokteren van het goede voedsel voor de betreffende organoïde, en om voor de bereiding daarvan een robuuste, reproduceerbare methode te maken. In Utrecht worden de humane organoïden gemaakt vanuit adulte stamcellen (ASC’s) uit adult weefsel. Voor deze ASC-organoïden wordt uit bijvoorbeeld de darm (of een ander orgaan) een klein stukje weefsel genomen. Dat snij je in hele kleine stukjes; chopping heet dat. Soms moet je het weefsel voorbehandelen met een trypsine-achtige buffer om de cellen er goed uit te krijgen. Vervolgens kan je met een hele milde collagenase-behandeling het weefsel een beetje open krijgen. De cellen stop je vervolgens in een gel die rijk is aan extracellulaire matrixeiwitten. Opgenomen in deze gel, die in de praktijk vaak met de merknaam matrigel wordt aangeduid, groeien de stamcellen op een gedefinieerd medium, waaraan een heleboel verschillende groeifactoren worden toegevoegd, zoals Wnt3a, R-spondin, epitheliale groeifactor (EGF) en noggin.
Afhankelijk van het celtype varieert de samenstelling daarvan en worden er nog andere stoffen aan toegevoegd. De stamcellen groeien zo uit tot kleine, net met het blote oog zichtbare klompjes van cellen, die met hun 3D-organisatie en de meerdere typen cellen die ze kunnen bevatten een goede weerspiegeling vormen van het orgaan waaruit de stamcellen zijn verkregen. Opmerkelijk aan deze ASC-organoïden is ook dat ze langere tijd kunnen groeien zonder dat er een feno- of genotypische verandering optreedt. Dit in tegenstelling tot 2D-cellijnen. In de praktijk wordt een organoïde dan ook na enige tijd (bijvoorbeeld een week in het geval van de minidarmen) weer in kleine stukjes opgedeeld, die op hun beurt weer uitgroeien tot organoïden en weer kunnen worden opgedeeld, enzovoorts.
Stieneke van den Brink laat zien hoe je met behulp van de vierlagige CELLdisc van Greiner Bio-One in een keer een grote hoeveelheid medium kunt bereiden. De suspensie met cellen, die een bepaald eiwit produceren, wordt vanuit een fles via een opening bovenop toegediend. Op die manier vul je in één keer de vier lagen. Na afsluiten van de opening kan je het medium gelijkmatig over alle lagen verspreiden door hem op een bepaalde manier te roteren. Daarna kan je hem gewoon rechtop in de incubator zetten. Als je moet oogsten maakt je de opening weer los en kan je alles er in één keer uitgieten.
Blijven optimaliseren
Vanuit de jarenlange ervaring met weefselkweek weten Stieneke van den Brink en haar collega’s altijd wel waar ze moeten beginnen als het op het ontwikkelen van een nieuwe methode aankomt. “Normaal darmweefsel kan je bijvoorbeeld veel gemakkelijker als organoïde kweken dan tumorweefsel. Zo heeft ieder weefsel zijn eigen compositie en dus ook zijn eigen voorkeur van eten, voor samenstelling van de media. Technieken als ‘single cell sequencing’ helpen ons daarbij ook een handje, omdat we daarmee de signatuur van een cel kunnen vaststellen. Heeft de cel bijvoorbeeld specifieke receptoren, dan is het vaak een slimme zet om een substraat te geven dat daarop af is gestemd. Maar het blijft toch ook spelen met hoeveelheden: het organoïde mag niet te snel groeien, en ook niet te langzaam.”
Omdat de organoïden, die worden gekweekt uit patiëntweefsel dezelfde genetische, morfologische en functionele eigenschappen hebben als het weefsel zelf, zijn ze zeer waardevol voor experimenteel en klinisch onderzoek, dat tot voor enkele jaren vooral op basis van diermodellen plaatsvond. Een bijkomend voordeel van de organoïden is dan ook dat hiermee de hoeveelheid dierproeven aanmerkelijk verminderd kan worden. “Er vindt inmiddels ook bij ons heel wat onderzoek plaats waarbij de organoïden genetisch worden gemodificeerd (met name met de CRISPR/CAS9 technologie) om bijvoorbeeld het effect van oncogene mutaties te onderzoeken. We zetten daarin steeds verdere stappen en zijn al zover dat we in de organoïden bepaalde functionaliteiten kunnen herstellen, zoals bijvoorbeeld de reparatie van de CFTR-locus in individuele darmstamcellen van patiënten met taaislijmziekte. Het bleek dat de gerepareerde stamcellen, die we lieten uitgroeien tot minidarmpjes, een functioneel CFTR-kanaal hadden. Nog een stap verder zou het zijn om genetisch gecorrigeerde longorganoïden terug te plaatsen in de longen van patiënten met taaislijmziekte. Zover zijn we echter nog niet.”
Snel en zorgvuldig
Bij het Hubrecht Institute worden voor de organoïden per week liters medium met de mix van groeifactoren gebruikt. De hiervoor benodigde eiwitten worden geproduceerd door specifi eke cellen, die zijn gehecht op de bodem van een plaat, en worden na bijvoorbeeld een week in de incubator met het groeimedium gewonnen. “Dat hebben we heel lang gedaan op losse petrischaaltjes of in kweekflessen. Op zich gaat dat prima, maar het brengt zeker met de grote hoeveelheden veel repeterend werk met zich mee, waarbij de kans op contaminatie er door de vele handelingen ook niet kleiner op wordt.
Om dit proces te versnellen hebben we eind vorig jaar een proef gedraaid met de door Greiner Bio-One ontwikkelde CELLdisc, een meerlagige (in ons geval vier lagen) CELLdisc van platen met een doorsnede van 20 cm. Het voordeel van deze oplossing is dat je niet meer elke plaat apart hoeft te behandelen. Met de CELLdisc kan je volstaan met het maken van een grote mix, die je via een opening bovenop toedient. Op die manier vul je in één keer de vier lagen. Na afsluiten van de opening kan je het medium gelijkmatig over alle lagen verspreiden door hem op een bepaalde manier te roteren. Daarna kan je hem gewoon rechtop in de incubator zetten. Ook als je moet oogsten is dat gemakkelijker: je maakt de opening weer los en je kunt alles er in één keer uitgieten. Dat werkt ook veel sneller: vijf minuten in plaats van een half uur pipetteren met de oude werkwijze. En het is ook een schoner proces, want de kans op een besmetting is met één keer overgieten veel kleiner dan met een kleine honderd keer afpipetteren, zeker voor mensen die minder ervaring hebben met celkweek”, vertelt Stieneke.
Ook voor het groeien van de organoïden wordt gebruikgemaakt van plastics van Greiner Bio-One, in dit geval 24-wells platen. “Ook hier hebben we gemerkt dat niet alle organoïden zich hetzelfde gedragen. Sommige cellen hebben zo sterk de neiging om zich aan het oppervlak te hechten dat ze letterlijk uit de matrigel breken. Dan kan je er niets meer mee. Voor dergelijke gevallen hebben we speciale repellent platen, die sterk afstotend zijn. Dan blijven de cellen wel netjes in de druppel matrigel zitten en kunnen de onderzoekers aan de slag met de organoïden.”
Meer informatie:
Hubrecht Institute
Het Hubrecht Institute heeft ongeveer 250 medewerkers, verdeeld over 24 onderzoeksgroepen, die fundamenteel, multidisciplinair onderzoek verrichten op tal van aspecten van ontwikkelings- en stamcelbiologie, zoals signalering in stamcellen en de vroege embryonale ontwikkeling, hartontwikkeling, regeneratie, epigenetica, genoomarchitectuur, celcycluscontrole, DNA-reparatie, dynamiek in genexpressie en kwantitatieve biologie van genexpressie. Dit onderzoek kan onder andere leiden tot innovatie bij behandelingen van kanker, diabetes en cardiovasculaire ziekten.
Het Hubrecht Institute is onderdeel van de Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen (KNAW) en bevindt zich op Utrecht Science Park. Sinds 2008 is het instituut geaffilieerd met het Universitair Medisch Centrum Utrecht. Dit bevordert de vertaling van het onderzoek naar de kliniek. Het Hubrecht Institute heeft een partnerschap met het European Molecular Biology Laboratory (EMBL). De grootste onderzoeksgroep is de Clevers groep, met circa 40 medewerkers, waaronder Stieneke van den Brink.
De groep bestudeert de moleculaire mechanismen achter weefselontwikkeling en kanker van verschillende organen, met behulp van organoïden die zijn gemaakt van mature Lgr5-positieve stamcellen uit zowel gezond weefsel als tumorweefsel. Met organoïden uit tumoren worden bovendien drugscreenings uitgevoerd en patiëntspecifieke behandelingen getest (personalized medicine).