Sinds 2019 brengt Diagnotix zelf ontwikkelde gestandaardiseerde kits voor de LC-MS bepaling van onder meer vitamines en steroïden op de markt. De oprichters van het bedrijf, Arie- Jan de Graaf en Mark Bonten, willen hiermee de vraag binnen met name de klinische chemie naar kant-en-klare oplossingen op dit gebied invullen. Focus ligt daarbij op service, kwaliteit en innovatie.
Een onderlinge variatie van 17% bij een test die wordt beschouwd als de ‘gouden standaard’. Die constatering, al weer enige jaren geleden gemaakt tijdens een NVKC-congres waar de fine-fleur op het gebied van LC-MS in de klinische chemie aanwezig was, bracht Arie-Jan de Graaf op het idee dat dat beter moet kunnen.
“Het probleem”, analyseert hij, “zit hem in het gegeven dat iedereen zijn eigen kalibratoren, zijn eigen standaarden maakt. En daarbij claimt 100% inwegen en 100% recovery te halen. Maar als dat het geval zou zijn, zou je met een techniek als LC-MS nooit zo’n grote onderlinge variatie zien. De contouren voor de oplossing waren wat mij betreft dan ook snel duidelijk: zorg ervoor dat iedereen met gestandaardiseerde oplossingen en materialen kan werken, zodat je die bron van variatie zo goed als mogelijk uitschakelt.” Niet veel later voegde hij de daad bij het woord. Samen met Marc Bonten, met wie hij bij een diagnostica- en reagentialeverancier werkte, richtte hij Diagnotix op om gestandaardiseerde kits voor klinisch-chemische en farmacologische LC-MS bepalingen te ontwikkelen en op de markt te brengen.
Groeimarkt
Diagnotix heeft inmiddels vier kits in het assortiment, voor de LC-MS bepaling van vitamine B1 & B6, methylmalonzuur, cortisol & cortisone in urine/speeksel en metanefrines in serum. Daar komen op korte termijn nog kits bij voor de bepaling van steroïden, vitamine D2/D3 en vitamine A & E, waarmee het bedrijf het leeuwendeel van de LC-MS bepalingen voor de klinische chemie heeft afgedekt. In de nabije toekomst zal dit programma verder worden uitgebreid richting met name de farmacologie.
Mede hiervoor is het Diagnotix team recentelijk uitgebreid met een expert op het gebied van farmacologische bepalingen. Iedere kit bestaat uit de benodigde interne standaarden, kalibratoren, controles, loopvloeistoffen en allerlei benodigdheden voor sample preparation, die allemaal bij Diagnotix zijn geproduceerd. Met één kit kunnen in de regel 200-300 bepalingen worden uitgevoerd. Arie-Jan de Graaf denkt dat de groei van LCMS bepalingen binnen de klinische chemie in Nederland en ook daarbuiten goede kansen biedt voor de nieuwe kits. “Alle grote en middelgrote labs hebben inmiddels één of meer LC-MS systemen staan. Ook de meeste kleinere labs voeren LC-MS bepalingen uit, waarbij ze in een samenwerkingsverband met andere labs in een LC-MS hebben geïnvesteerd.
Belangrijke drijfveer is dat laboratoria voor deze bepalingen niet langer vasthouden aan HPLC. Als een HPLC moet worden vervangen kopen ze veelal niet meer een nieuwe HPLC, maar investeren ze in een LC-MS. De investeringskosten zijn dan wel hoger, maar die heb je er op basis van de prijs per test binnen drie jaar uit. Het grote economische voordeel van LC-MS ten opzichte van de HPLC is de snelheid; er gaan veel minder analistenuren inzetten. Die snelheid is ook wenselijk in verband met de groei in aanvragen van sommige bepalingen. Dat zien we bij vitamine B1 & B6, waar je met HPLC door een complexere monstervoorbewerking (6 tot 7 stappen tegen 2 voor LC-MS) en een langere runtijd (12 minuten tegen 4 voor LC-MS) veel sneller aan je maximale capaciteit zit. Vitamine D, dat inmiddels in de top tien van aanvragen staat, is zo populair geworden dat zelfs een LC-MS vaak onvoldoende capaciteit biedt. Dat gaat nu vaak mee op de analyzer voor immuno-assays, die echter niet altijd even selectief zijn.”
CTO Arie-Jan de Graaf (rechts) en Purchase & Supply Chain Manager Marc Bonten van het onlangs opgerichte bedrijf Diagnotix bij de door Veolia Water Technologies geleverde Elga waterzuiveringssystemen waarmee ultrapuur water wordt gegenereerd dat zowel in het applicatielaboratorium als voor de productie van de LC-MS kits wordt gebruikt.
Judith Boom is een van de momenteel
zes vaste krachten in het laboratorium.
Methode-ontwikkeling
Achter iedere kit zit een omvangrijk traject van methode-ontwikkeling. Onder meer daarvoor is Bart-Jan Komen aangetrokken. “Ik kende Bart-Jan al van de tijd dat hij als klinisch chemisch analist bij het ziekenhuis in Alkmaar pionierde in de LC-MS met de opzet van een methode voor vitamine B1 & B6. Met zijn expertise kunnen we het ontwikkelproces stroomlijnen, versnellen en verbeteren.
Methodeontwikkeling begint bij ons vanuit de literatuur, waarbij we een gedegen theoretische onderbouwing van de methode maken. Vanuit de molecuulstructuur bepaal je of je in de positieve of negatieve modus gaat meten, wat de polariteit van de stof is, of die hydrofoob of hydrofiel is, welke functionele groepen er aan zitten, enzovoorts. Daar zoek je dan een passende kolom bij en geschikte loopvloeistoffen. Bij LC-MS kan je geen zouten gebruiken, dus fosfaatbuffers zijn uit den boze. Formiaatbuffers of mierenzuur kan dan weer wel. Het is de kunst om de gradiënt zo in te stellen dat de componenten snel van de kolom af diffunderen, waarbij deze goed gescheiden zijn en een goed signaal geven. Zijn de componenten stabiel of instabiel? Moeten we het materiaal wel of niet vriesdrogen? Vragen die we ook voor de interne standaard willen beantwoorden.”
Bart-Jan Komen houdt zich als LC-MS specialist bezig met methode-ontwikkeling en het optimaliseren van de applicaties bij klanten van Diagnotix die LC-MS willen gebruiken voor klinisch-chemische bepalingen. Stagiair Davidson Blasse, die achter hem staat, helpt hem daarbij.
De gestandaardiseerde kits voor klinisch-chemische LC-MS bestaan uit interne standaarden, kalibratoren, controles, loopvloeistoffen en reconstitution oplossingen, die allemaal bij Diagnotix zijn geproduceerd.
Kennisoverdracht
Bij elke methode zit ook nog een stuk monstervoorbewerking, in de regel (een combinatie van) onteiwitting, vloeistof-vloeistofextractie of SPE. “In dit traject is ook heel wat te winnen. Soms zie je bijvoorbeeld dat er met hele kleine piekjes/oppervlaktes wordt gewerkt. Door te finetunen, een andere kolom te gebruiken, een concentratiestap toe te voegen of een ander scheidingsprincipe te hanteren, kan je dit verbeteren.
Ook in het meettraject met de LC-MS zijn er vaak nog allerlei praktische tips te geven die tot betere resultaten met onze kits leiden. We beperken ons dan ook niet tot het sec leveren van de kits, maar we leveren ook een stukje service. We gaan in dat kader bijvoorbeeld naar de klant om de applicatie voor hem te maken, de LC-MS te programmeren en trainingen te geven. Op verzoek zijn ook validatierapporten beschikbaar volgens de EP5 en EP9 protocollen. Voor deze ondersteuning nemen wij de tijd zodat de klant met de kit aan de slag kan gaan. En ook daarna blijven we in contact met de klant en leveren we de nodige nazorg: op de LC-MS hier op het lab in Appingedam kunnen we problemen nabootsen, zodat we snel op afstand een goede diagnose en oplossing kunnen leveren. De markt wil een kant-en-klare oplossing, niet alleen voor nu, maar ook voor de toekomst. Daarom is die aanloopperiode zo belangrijk, dat mensen weten waar ze op moeten letten”, vertelt Arie-Jan de Graaf enthousiast.
Dezelfde matrix als patiëntenmateriaal
Een belangrijke pré van de standaarden en controles uit de kits van Diagnotix is dat ze in dezelfde matrix worden gemaakt als die van het patiëntenmateriaal voor de betreffende test. Voor vitamine B1 & B6 is de test in volbloed, dus zijn de kalibratoren en controles ook in volbloed of hemolysaat. Voor andere kits gaat hetzelfde verhaal op met betrekking tot serum, plasma of urine. “Ziekenhuizen die hun eigen standaarden hanteren, maken veelal gebruik van waterige of organische oplossingen. Daarvoor wordt wel gecorrigeerd op basis van een interne gedeutereerde standaard, maar dat is niet ideaal”, stelt Marc Bonten.
“ Farmaceutische labs en klinische labs in ziekenhuizen werken steeds meer samen. Wij kunnen beide bedienen, want ze werken vaak op dezelfde LC-MS systemen.”
Vriesdrogen
Een verdere beperking in de variatie wordt bereikt door toepassing van vriesdrogen bij de productie van standaarden, kalibratoren en controles. Dit proces vindt ook in het pand van Diagnotix in Appingedam plaats. “Het gegeven dat je met deze productietechniek grotere batches –in ons geval 1.500 tot 2.000 flesjes per batch– kunt produceren, die ook nog eens langer houdbaar zijn, leidt tot meer standaardisatie. Vanuit een grote mengkom, waarin een bepaalde hoeveelheid van je referentiestof is opgelost in dezelfde matrix waarmee het patiëntenmateriaal wordt gemeten, ga je uitpipetteren in kleine vriesdroogflesjes.
Na er een vriesdroogstopje op te hebben geplaatst worden ze bij -80 °C in de vriezer gezet. In de vriesdroger is er een temperatuur van -45 °C op de platen en -70 °C tot -90 °C bij de condensor. Onder vacuüm wordt nu langzaam het vocht uit het product onttrokken. Nadat de temperatuur weer is verhoogd tot kamertemperatuur worden de stopjes onder vacuüm automatisch aangedrukt. Het product is nu vochtvrij en onder vacuüm afgesloten. Deze procedure resulteert in een houdbaarheid van tenminste vier jaar, wat ruim voldoende is voor een klant om een grote batch af te nemen zodat die langdurig met exact dezelfde kalibratoren, standaarden en controles kan werken. De gevriesdroogde producten moeten in een aangegeven hoeveelheid gepipetteerde oplossing worden opgelost; de vloeistoffen zijn dan enkele dagen houdbaar in de koelkast of enkele weken in de vriezer”, legt Marc Bonten uit.
Ultrapuur water
Zowel voor productie als bij het meten aan de LC-MS is ultrapuur water nodig. Hiervoor maakt Diagnotix gebruik van een door Veolia Water Technologies geleverde configuratie, die bestaat uit twee waterzuiveringssystemen en een buffervat van 100 liter. Het op de kraan aangesloten Elga Chorus 2 systeem uit de Purelab Chorus-reeks produceert demiwater, dat als voeding dient voor het andere systeem, de Purelab Chorus 1. Die maakt er vervolgens ultrapuur water van. In dit water zit helemaal niets meer dat storend kan zijn voor de MSmetingen; geen mineralen, geen ionen, geen bacteriën. Er is ook totaal geen geleiding meer te meten. “Met die buffer van 100 liter hebben we ruim voldoende capaciteit. Zeker voor productie, want daarvoor hebben we het meeste nodig voor de mobiele fases, die we afvullen in 500 ml flessen. Het vullen van 2.000 0,5 ml flesjes, die in een reguliere batch zitten, is daarbij vergeleken te verwaarlozen. Het meeste water wordt gebruikt voor spoelen van niet alleen je systemen, maar ook al het glaswerk, zowel van productie als van het lab. Daar zijn we heel strikt in. Een maatcilinder moet altijd schoon worden weggezet, en als we hem opnieuw gebruiken moet die ook weer worden gespoeld met ultrapuur water. Wat kwaliteit betreft hebben we geen enkele compromis.”