Steven Vermeulen en Erik Vrij, beiden postdoc bij de onderzoeksafdeling ‘Instructive Biomaterial Engineering’ (IBE) van het Institute for Technology- Inspired Regenerative Medicine (MERLN) in Maastricht, hebben eind vorig jaar het BioStudio-T imaging platform van Nikon uitgetest. Het apparaat is zo klein dat het in een standaard incubator past, wat het tot een laagdrempelige tool voor live cell imaging maakt.
In de altijd drukke laboratoria voor cel- en weefselkweek van het MERLN instituut wordt in het kader van de coronamaatregelen in shifts van zes uur gewerkt. Voor de eerste shift moet je er vroeg bij zijn, want die begint al om zes uur in de ochtend. Voor postdoc Steven Vermeulen heeft dat wel wat. “Als je zo vroeg begint, ben je in het begin van de middag weer thuis; voor je gevoel heb je dan nog zeeën van tijd om resultaten uit te werken, publicaties te lezen of te schrijven. Lastig is wel dat je je experimenten in die zes uur moet inplannen.” Zijn collega Erik Vrij kan dit beamen, al is het soms wel wat lastig bij het lesgeven. “Als dat precies in je lab-shift valt, moet je alles weer omzetten; dat is soms een heel gepuzzel. Ook vind ik het jammer dat je nieuwe onderzoekers niet gemakkelijk leert kennen, omdat onze open office dicht is. Het is altijd leuk om die mensen op sleeptouw te nemen. Met die altijd volgeplande shifts vraag ik mij trouwens wel af hoe in straks weer normale tijden al dat experimenteerwerk van die 18 uur weer in een gewone werkdag kan worden gepropt!”
Drie takken van sport
In de tien laboratoria, die over drie verdiepingen van enkele gebouwen van het MUMC-complex zijn verdeeld, houden circa 100 onderzoekers zich bezig met een mix aan bio(techno)logisch en materiaalonderzoek en -engineering. Dat onderzoek is gestructureerd in drie onderzoeksafdelingen, met ieder vier of vijf onderzoeksgroepen die worden geleid door een PI (principal investigator). De onderzoekers van CTR (‘Complex Tissue Regeneration’) zijn gespecialiseerd in geavanceerde micro- en nanobiofabricagetechnologieën voor het maken van 3D-celculturen, onder andere het ontwerp en de engineering van scaffolds en hydrogels voor de regulering van celactiviteit en weefselvorming. Bij cBITE (‘Cell Biology-Inspired Tissue Engineering’) ligt de focus op moleculaire en cellulaire technieken voor de regeneratie van weefsels en organen. Bij IBE (‘Instructive Biomaterials Engineering’) wordt onderzoek gedaan aan biomaterialen, met kerameken als belangrijk focusgebied. Daarbij gaat het niet alleen om de synthese van dit soort composieten maar ook hoe ze in bioorganische (bot)constructen de groeiomstandigheden voor cellen beïnvloeden.
Steven Vermeulen gebruikt deze microscoop in het weefselkweeklab vooral voor snelle imaging: even je cellen of organoïden bekijken door middel van bright-field microscopie of fluorescentie op de aanwezigheid van genetische reporter constructen in de cellen en weefsels.
Moduleren van micro-omgeving
Erik en Steven maken voor hun onderzoek gebruik van zogenaamde microwell’s. Dat zijn kleine bakjes van een paar honderd micron diep en breed, waarin je cellen kunt zaaien die dan automatisch een klompje vormen, dat kan uitgroeien tot een organoïde. “We creëren een 3D-omgeving die anders is dan de standaard niet-fysiologische 2D-cultuuromgeving, die niet optimaal is voor cellen. In vergelijking met 2D-platen of organoïden die in een druppeltje watergel worden gekweekt op een kweekplaat, kunnen wij onze 3D-micro-omgeving beter moduleren en aanpassen aan het weefel of celtype waarin we geïnteresseerd zijn. We kunnen de microwell’s materiaaltechnisch zo inrichten dat de cellen zich niet hechten aan de wand, maar aan elkaar gaan plakken en klompjes cellen vormen. Je kunt ze ook wel laten aanhechten, door een chemisch motief of een microtopografie aan te brengen. Ook zijn er microwelletjes ontwikkeld met een membraan zodat je co-kweek kunt doen met twee verschillende celtypen. We hebben dus meerdere technieken beschikbaar wat ons vele mogelijkheden geeft om cellen te sturen en te onderzoeken. Dat kunnen allerlei cellen zijn, maar in zowel het onderzoek van Erik als dat van mij ligt de focus op stamcellen. Naast het veranderen van de structuur van de omgeving kunnen we ook variaties in het medium aanbrengen waarin de cellen zich bevinden, bijvoorbeeld het toevoegen van cytokines om een immuunrespons op te wekken.
Andere tools zijn microfluïdische chips, waarbij je in plaats van statisch medium een continu vers stromend medium hebt. Verder zijn er ook water-in-olie emulsies waarmee je op microniveau cellen en materiaalobjecten kunt samenvoegen op een gecontroleerde manier, er zo veel tegelijk kunt produceren, wat weer ideaal is voor high-throughput werk”, beschrijft Steven het Maastrichtse mer-à-boire aan onderzoekstools en -technieken.
Erik Vrij bij een van de geavanceerde Nikon-microscopen in het MERLN-microscopielab waarmee hij cell imaging experimenten uitvoert.
Een montageplaatje van met de BioStudio-T gemaakte bright-fi eld opnames van zogenaamde rosettes. Dat zijn stamcellen die zijn georganiseerd tot een structuur die de vroege epiblast en primitief endoderm nabootst van het muizenembryo. Tijdens de natuurlijke ontwikkeling van het embryo groeien deze uit tot het muisje zelf en de dooierzak.
Botweefsel uit stamcellen
Het onderzoek van Steven is gericht op het maken van botweefsel uit stamcellen en het ontwikkelen van modellen voor ziektebeelden die zijn gerelateerd aan defecten in botweefsel. “In de microwell’s willen we vanuit iPSC’s –dat zijn pluripotente cellen die je kan laten differentiëren naar elk celtype–, of vanuit volwassen stamcellen in een 3D-omgeving een organoïde maken van botcellen. Hiermee kunnen we bestuderen wat er in de ontwikkeling gebeurt, zodat je methodes kunt optimaliseren om vanuit de organoïden effectief weefsel te kunnen maken. Een toepassing waar we momenteel aan werken, is het brengen van die organoïden in een patiënt waarbij ze kunnen uitgroeien tot botweefsel.”
De organoïden kunnen ook dienen als basis voor een ziektemodel, bijvoorbeeld artosclerose, een calcifi catie van je aderen. Hierbij worden organoïden gemaakt op basis van endotheelcellen die je ook in de aderen terugvindt. Door bepaalde stoffen aan de cellen toe te voegen zullen ze calcifi ceren, zoals dat ook gebeurt als je artosclerose hebt. De ‘zieke’ organoïden kan je vervolgens screenen op een bibliotheek van componenten, die een mogelijk therapeutisch effect hebben. “We werken er naar toe om dat in een high-throughput opzet te doen, met veel verschillende microwell’s en duizenden verschillende componenten. Daar zitten er wellicht een paar tussen met potentie voor een klinisch testtraject, waarbij de gedachte is dat de kans op een positieve uitkomst groter is dan bij stoffen die naar boven zijn komen drijven in studies die zijn gebaseerd op diermodellen Een organoïde heeft een grotere gelijkenis met wat je in je lichaam terugvindt, en heeft dan ook een grotere voorspellende waarde, zo is de gedachte. De praktijk moet nog wel uitwijzen of die vooronderstelling terecht is!”
In de altijd drukke laboratoria voor cel- en weefselkweeklab van het MERLN wordt in het kader van de coronamaatregelen in shifts van zes uur gewerkt.
Imaging
Het calcifi catieproces kan in de tijd worden gevolgd onder een microscoop op basis van het verkleuren van cellen die calcifi ceren. Voor dergelijke experimenten (en vele anderen) kunnen de onderzoekers al jaren terecht bij geavanceerde live cell imaging units van Nikon. Deze microscopen staan in het microscopielab, enkele etages lager dan de laboratoria voor cel- en weeselkweek. Tijdens een testperiode van ongeveer een maand van een nieuw apparaat van Nikon, de BioStudio- T, hebben de onderzoekers ervaren dat live cell imaging niet per se met de geavanceerde microscopen hoeft te gebeuren, maar ook in de laboratoria voor cel- en weeselkweek mogelijk is.
“De BioStudio-T is zo klein, dat je hem gewoon in een incubator kunt zetten. Dat heeft als voordeel dat we veel sneller kunnen werken: we hoeven niet eerst naar beneden naar het microscopielab om het toestel op te starten, waarna we ook weer moeten wachten tot de gewenste temperatuur is bereikt. Vanaf het moment dat de plaat klaar is, en je wilt gaan imagen, is het met de BioStudio-T slechts een kwestie van de plaat er insteken, de deur dichtdoen, in de software nog wat instellingen aanpassen en dan op start drukken. Dat kost je niet meer dan tien minuten”, vertelt Steven.
Autofocus
“Een handige optie is de autofocus”, vult Erik aan. “Je kunt in de software het patroon van de well’s in je plaat aangeven, waarna de imaging unit zelf de cellen kan vinden, daarop kan focussen en automatisch zorgt voor scherpe foto’s. Hierbij verschuift de lens per welletje en neemt zo van ieder welletje bijvoorbeeld ieder half uur een foto. Dit blijkt goed te werken in time-lapse experimenten van twee tot drie dagen die we hebben uitgevoerd in 96- of 384-well’s platen met de microwelletjes. De PC-software kan goed overweg met de grote datafi les en maakt er mooie fi lmpjes van. Dat maakt live cell imaging tot een toegankelijke tool, ook voor andere andere groepen die nog niet aan live cell imaging doen.” “En voor ons maakt het het werk een stuk gemakkelijker. Met door Nikon toegezegde extra software die is toegespitst op onze toepassingen is het voor ons dusdanig interessant dat ik in een van de volgende onderzoeksaanvragen budget voor de aanschaf van een BioStudio-T wil meenemen”, aldus Steven.
Blastoïden
Het onderzoek van Erik speelt zich af op het gebied van blastoïden; embryomodellen die vanuit de stamcellen zijn gevormd. In 2018 was hij mede-auteur (eerste auteur Nicolas Rivron was zijn PhD-supervisor) van de Nature paper over een nieuwe techniek om muizenembryo’s geheel op te kweken uit stamcellen, en niet vanuit een bevruchte eicel. “Het ging toen om twee celtypes: embryonale stamcellen en trofoblaststamcellen waaruit de placenta groeit. Het spontaan gevormde embryoachtige bolletje kon zich ontwikkelen tot een stadium dat overeenkomt met een muizenembryo van bijna vier dagen oud. Om die ontwikkeling te verlengen is de afgelopen jaren gewerkt om een derde stamceltype aan het model toe te voegen, dat verantwoordelijk is voor de vorming van de dooierzak. Hiermee gaat de ontwikkeling een stukje verder, tot na de nesteling in de baarmoeder.” “We kunnen met dit soort embryomodellen heel toegankelijk de ontwikkeling van het embryo bestuderen omdat je er relatief gemakkelijk honderden tot duizenden kunt maken. Daar kan je dan weer high-throughput screening op doen met imaging met de microscoop als belangrijkste readout. In dit geval gaat het dan wel om fl uorescentie-imaging, waar de BioStudio-T zich niet voor leent, omdat die alleen geschikt is voor bright-fi eld. Maar de met vocht gevulde holte van de blastoïden kan je wel zien met bright-fi eld microscopie. In samenwerking met Nikon zijn herkenningspunten gedefi nieerd in de blastoïd-vorming. Door die in de software automatisch te herkennen, kan je live de vorming detecteren en de yield/effi ciency bepalen van de vorming op een specifiek tijdstip. Hierin kan de BioStudio-T dus ook een effectieve tool zijn.”